研究目的

本研究以福建省顺昌县采集的无患子病样组织为研究对象，通过组织分离法、致病性测定、形态学鉴定及分子生物学鉴定，确定无患子叶斑病病原菌种类，在此基础上探究病原菌生物学特性，研究结果将为无患子叶斑病的科学防治提供依据。

材料与方法

(1)菌株的分离培养与纯化：用组织分离法对菌株进行分离。

(2)致病性测定：以有伤和无伤接种法接种菌饼，再取接种发病后的部位进行组织分离、镜检观察。

(3)形态学鉴定：包括菌落形态特征观察和菌落显微特征观察。

(4)分子生学物学鉴定：试剂盒法提取病原菌DNA，进行ITS序列扩增、进行测序、结果比对及亲缘关系校正，最后构建系统发育树。

(5)生物学特性研究：探究不同培养基、不同碳、氮源、温度、pH值、光照对菌丝生长的影响及菌丝致死温度测定。

主要结果

（1)病害症状

该病害主要为害无患子叶片，患病初期该部位出现黄褐色斑点，后逐渐向外扩展，形成不规则的淡褐色或深褐色的病斑，病斑上常伴有黑色小点（图1A），潮湿条件下会产生黑色墨汁状液体（图1B）。

(2)病原菌分离及致病性测定

对组织分离法分离出的9种菌株进行致病性测定，发现接种SW-9菌饼的无患子叶片在有伤接种与无伤接种的情况下均能产生黄褐色不规则病斑（图1C、1D），按科赫式法则对接种的发病叶片再进行分离、纯化，获得与原始菌株一致的菌株，表明SW-9为致病菌株。

图1无患子叶斑病症状及致病力测定

(3)形态学鉴定

菌落在PDA培养基28℃培养7d和30d后，菌落形态分别如（图2A、图2B）和（图2C、图2D）。在综合PDA固体培养基上培养30d可形成子座（图2E）；分生孢子器椭圆形（图2F）；孢子椭圆状，单孢，光滑（图2G）。

图2病原菌形态学鉴定

（4）分子生物学鉴定

通过对SW-9的ITS序列进行比对，发现SW-9的ITS序列与Xylariaarbuscula(JQ)的一致性为99.64%。进一步进行系统进化聚类分析（图3），最后结合形态学特征和进化分析，将菌株SW-9鉴定为Xylariaarbuscula。

图3基于ITS序列和邻接法构建系统发育进化树

(5）生物学特性研究结果

不同培养基对菌落生长的影响

该病原菌菌丝在不同培养基上生长速度和菌落特征差异较大（图4）。菌落在PDA生长最好，其次为Czape及PSA培养基。

图4不同培养基对菌落生长的影响

不同碳、氮源对菌落生长的影响

不同碳、氮源对病原菌菌丝生长的影响差异显著。在碳素营养中，菌丝对麦芽糖利用效果最好；在氮素营养中，以蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏的利用效果好。

不同温度对菌落生长的影响

不同温度条件对病菌菌丝生长影响显著。病原菌在5~35℃内均能生长，最适温度为28℃（图5）。

图5不同温度对菌落生长的影响

不同pH、光照对菌落生长的影响

在pH5~13范围内该病原菌均可生长，喜偏酸条件，最适生长的pH范围是6~7；24h全黑暗条件下菌落生长相对较快，菌落直径为5.69cm。

菌丝致死温度测定

对该病原菌菌丝致死温度测定的结果见表1，40℃以上菌丝均不能生长，因此该病原菌的致死条件为40℃、10min。

表1丝致死温度测定

讨论与结论

炭角菌属Xylaria，是一种真菌，为炭角菌科的模式属。炭角菌的生境较广，炭角菌属有些种类是重要的植物病原菌。但关于Xylariaarbuscula引起的无患子叶斑病为首次报道。

通过对无患子叶斑病病原菌（Xylariaarbuscula）生物学特性研究发现，该菌生长的温度范围较广，酸碱度的适应能力较强，光照条件对该菌的生长影响较小。

参考文献

郑婉铮,孙宇,林先云,等.无患子叶斑病病原菌鉴定及其生物学特性[J].四川农业大学学报,,39(5):-.

原作：郑婉铮

文本：曹秋丽

审定：赵国春

编辑：曹秋丽